×
Katedra myslivosti a lesnické zoologie
banner

Laboratorní práce

Věda a výzkum > Laboratorní práce

   Na katedře myslivosti a lesnické zoologie máme tři nová laboratorní zařízení. Nejprve byla vytvořena zcela nová biofyzikální behaviorální laboratoř se dvěma magnetickými cívkami, zesilovači signálu a záznamovým zařízením pro provádění magnetorecepčních experimentů ve vysoce kontrolovaném prostředí. Zde můžeme nastavit všechny důležité proměnné včetně barvy a intenzity světla, síly, směru a hustoty magnetických polí, teploty vzduchu a vody atd.

   V každé ze dvou zkušeben jsou zvířata vystavena umělému regulovanému magnetickému poli vytvářenému cívkou pod boxem nebo arénou, ve které se mohou volně pohybovat. Tabulka pod arénou obsahuje také prostory pro instalaci tyčových magnetů. Videokamera s vysokým rozlišením je připojena k počítači pomocí analytického softwaru a výkonné databanky schopné ukládat terabajty dat. Stěny a dveře laboratoře a zkušebny jsou plně chráněny před zvukovým šumem a silnými magnetickými poli vytvářenými elektronickými zařízeními v budově. Ale nejen ty – speciální materiál používaný k izolaci také odstraňuje rádiové vlny z mobilních telefonů, WiFi atd., o kterých je známo, že působí proti určitým typům magnetoreceptivních procesů. Zvířata ve zkušebnách jsou plně izolována jak od experimentátora, tak od vnějšího prostředí, což umožňuje úplnou kontrolu experimentálních podmínek rozhodujících pro extra citlivé magnetoreceptivní reakce.

   Sofistikovaný systém zesilovačů signálu a dva výkonné počítače jsou umístěny ve velínu, kde mohou experimentátoři sledovat průběh testu, aniž by ovlivňovali a rušili testované subjekty.

   Příkladem experimentů, které lze provádět v magnetické cívce, je test magnetického zarovnání. Je známo, že za klidných podmínek mají zvířata tendenci spontánně srovnávat své tělo podél severojižní osy magnetického pole. Můžeme umístit zvíře do arény uvnitř cívky, nastavit požadované parametry (síla, směr atd. magnetického pole) a poté zaznamenat přesnou polohu těla zvířete a jeho přesný úhel vzhledem k ose magnetického pole.

   Zvířata použitá při pokusech by měla být umístěna mezi experimenty v bezpečí a pohodlí. Za tímto účelem je v sousední části organizována laboratoř pro zvířata. Skládá se z akvarijní místnosti pro chov ryb a obojživelníků a místnosti s klecemi a plastovými bednami pro chov králíků, morčat a drobných hlodavců. Všechny části zařízení jsou vyrobeny z nemagnetického materiálu nebo chráněny proti magnetickému poli. Stěny laboratoře pro zvířata jsou také chráněny, abychom mohli odstranit jakýkoli zdroj rušení, které by mohlo ovlivnit kontrolované chování zvířat. Systémy pro základní životní potřeby zvířat jsou alespoň částečně řízeny elektronicky.

   Laboratorní výzkum zahrnující mikroskopii s vysokým rozlišením, molekulární analýzy a histologické postupy je zbrusu novým trendem v činnosti katedry myslivosti a lesnické zoologie. Věda v 21. století značně přechází z makroúrovní na mikroúrovně s rychlým vývojem metod sekvenování genomu a analýzy proteinů, stejně jako sofistikované počítačové technologie bioimagingu a zpracování obrazu – a my jako biologové volně žijících živočichů se musíme tohoto tempa držet. Ve spolupráci s dalšími pracovišti a fakultami ČZU jsme založili nový laboratorní prostor pro molekulární výzkum v budově Hi-Tech a suterénu FLD, kde máme všechny prostředky potřebné k odběru laboratorních vzorků a jejich předzpracování.

   V jedné z laboratoří máme prostor pro přípravu vzorků, počáteční zpracování a skladování. Vzorky krve, výkalů, moči a biologických tkání, které se shromažďují za účelem sledování fyziologického stavu zvířat v experimentu, se skladují zmrazené v objemných výkonných mrazničkách při -25 °C. Vedle nich máme laboratorní stoly se zařízením pro homogenizaci, centrifugaci a pipetování, které umožňují extrahovat sledované látky (DNA, RNA, proteiny, steroidní hormony atd.) ze surových vzorků a dále je zpracovávat ve specializovaných molekulárních laboratořích na ČZU nebo jiných institucích.

   V naší laboratoři tedy můžeme připravit vzorky pro sekvenování DNA používané pro různé účely od identifikace druhů a barcoding DNA až po komplexní fylogeografické analýzy. Můžeme také bezpečně uchovat tkáně pro extrakci a sekvenování RNA, abychom mohli studovat expresi specifických genů spojených s behaviorálními reakcemi, nebo extrahovat steroidní hormony (kortizol, DHEA atd.) Pro zátěžové experimenty prováděné v magnetických cívkách nebo ve volné přírodě.

   Například pro měření hladin steroidních hormonů u divočáků sbíráme vzorky krve, které je třeba nejprve centrifugovat, aby se oddělilo sérum se steroidy z krevních buněk. Sbíráme také výkaly, které mají být před extrakcí vysušeny ve SpeedVacu, homogenizovány a zváženy. Proces extrakce je relativně jednotný pro různé typy vzorků z hlediska použitých chemikálií (ethylacetát nebo čistý ethanol). Specifické protokoly se skládají z několika sekvencí pipetování, víření, centrifugace a sušení ve SpeedVacu v různých kombinacích. Extrahované steroidní pelety jsou poté hluboce zmrazeny, dokud nejsou použity pro metodu ELISA.

   Pro extrakci DNA a RNA z čerstvých vzorků nebo vzorků fixovaných ethanolem používáme komerční soupravy, které nám umožňují důkladně oddělit nukleové kyseliny od mastných nebo proteinových sloučenin, vyčistit a koncentrovat vzorky, aby byla zajištěna vysoce kvalitní amplifikace.

   V budově Hi-Tech máme zcela nové vybavení pro světelnou mikroskopii a histologii zvířat. Některé druhy zvířecích tkání, zejména mozkové tkáně, vyžadují velmi jemnou přípravu řízků s minimem fixačních postupů. Za tímto účelem máme nový kryotom Leica CM1860 (mrazící mikrotom), pomocí kterého je možné připravit řízky o tloušťce do 1 µm. Dalším moderním zařízením pro jemné nebo imunohistochemicky obarvené tkáně je Vibratome (vibrační mikrotom pro řezání vzorků vložených do agarózy), který má být brzy přidán k našemu vybavení.

   K získání vysoce kvalitních histologických obrazů jsou nutné pečlivě připravené vzorky tkání a diapozitivy. V naší laboratoři máme nové vysoce kvalitní histologické vybavení pro barvení a sušení biologického materiálu a obrovský výběr špičkových chemikálií od předních společností (Merc, Invitrogen, Sigma Aldrich atd.) pro konvenční a fluorescenční histochemii.

   Sada vysoce kvalitních světelných mikroskopů OLYMPUS s vestavěnými digitálními barevnými foto/videokamerami umožňuje získat vysoce kvalitní tkáňové obrazy fixované a obarvené konvenčními metodami. Perspektivně plánujeme rozšířit spektrum histologických metod na různé techniky imunofluorescenčního barvení, což umožní detekovat nejmenší a nejvíce unikající struktury organismu, které lze použít pro složité a citlivé reakce, jako je magnetorecepce.

Odběr vzorků při loveckých akcích

   Stres je důležitým faktorem dobrých životních podmínek zvířat. Dlouhodobý výzkum stresu se zaměřuje hlavně na člověka a hospodářská zvířata, zatímco stres divokých zvířat a zejména zvěře je stejně důležitý. Přirozené i antropogenní stresory jako jsou změny počasí a cestovní ruch se zvyšují. Rozmach měst podporuje konflikt mezi člověkem a divokými zvířaty, který vede k behaviorálním a fyziologickým změnám, včetně stresových reakcí zvířat.

   Hodnocení dobrých životních podmínek zvířat a dohled nad chorobami u volně žijících druhů může být docela náročné. Hodnocení stresu v zásadě vyžaduje krev nebo výkaly z mrtvých nebo chycených zvířat. U většiny analýz musí být vzorky čerstvé a bez kontaminace. U volně žijících druhů zvěře je proto vzorkování po loveckých akcích nejjednodušší. Speciálně naháňky a řízené hony umožňují snadný odběr vzorků ve velkém množství. Na katedře myslivosti a lesnické zoologie odebíráme krev od usmrcených divočáků propíchnutím kavernózního sinu. To nám poskytuje rychlé a čisté vzorky krve v dostatečném objemu pro různé typy analýz. Především se vzorky používají k měření hladin hormonů a dalších parametrů, jako jsou hladiny hematokritu a glukózy. Data se používají k vyhodnocení úrovní stresu jednotlivců během loveckých akcí i k vyhodnocení dlouhodobého stresu. Kombinace různých parametrů poskytuje hrubé hodnocení aktuálního zdravotního stavu zvířete a umožňuje také některé rekonstrukce minulých podmínek, aby se zkontrolovaly rozdíly závislé na čase, situaci a poloze.

Přítomnost parazitů

    Hustota obyvatelstva a chování zvěře často kolísá v důsledku přenosu parazitů a nemocí. Paraziti jsou organismy žijící v hostiteli nebo na hostiteli, živící se hostitelem nebo na jeho náklady a využívající ho k reprodukci. Negativně ovlivňují kondici hostitelů a mohou mít za následek změny chování hostitelů. Detekce parazitů je také důležitá pro hodnocení kvality masa. Za tímto účelem se tkáň ulovených zvířat kontroluje na viditelné známky parazitů a krev a tkáň lze vyšetřit v laboratořích. Jedním z nejběžnějších parazitů jsou parazitičtí červi (helminti). Dospělé lze vidět pouhým okem, což usnadňuje jejich detekci po vyvržení ulovené zvěře. Vzhledem k tomu, že většina hlístů infikuje gastrointestinální trakt, lze vejce najít ve stolici hostitele.

   Katedra myslivosti a lesnické zoologie výše zmíněné metody využívá k neinvazivní detekci a sledování napadení a přenosu parazitů ve volně žijících skupinách divokých prasat ve vybraných oblastech v České republice. Skupiny lze identifikovat pomocí jedinců s GPS obojkem, o nichž je známo, že se pohybují ve skupinách. Zátěž parazitů helmintů je odhadnuta pomocí semikvantitativních metod počítání. Pomocí jednoduchých flotačních a sedimentačních metod jsme již byli schopni detekovat vajíčka druhů helmintů, jako je Ascaris suum (Obr. 1), Capillaria sp. (Obr. 2), Metastrongylus sp. (Obr. 3 nahoře) a Strongyles (Obr. 3 dole), kteří jsou běžnými parazity divočáků.